加州理工学院Viviana Gradinaru团队之前开发了AAV变体，例如AAV-PHP.eB，其在啮齿动物中可通过静脉注射有效穿越血脑屏障，对大脑细胞具有广泛靶向性。她的团队还开发了一些具有细胞类型特异性靶向的AAV变体，例如PHP.V1，其可通过静脉注射穿越血脑屏障，对大脑内皮细胞具有更强的靶向，但也会靶向星形胶质细胞和神经元，此外，PHP.V1需要细胞类型特异性启动子，其大尺寸限制了用来递送基因时的选择，并且仅在某些小鼠品系中起作用。

基于AAV的基因递送还面临一个问题——难以重复给药，第一次给药后诱导产生的中和抗体可能会导致重复给药的AAV被中和。这就需要在第一次给药时尽可能地提高治疗效果。作为最主要的体内基因治疗递送载体，AAV载体已被用于递送多种基因以治疗不同类型的疾病。一种对大脑脉管系统具有特异性靶向的AAV将为基因治疗提供新的策略。这是因为脉管系统在大脑中广泛分布，且与中枢神经系统内的其他细胞类型接近。因此，AAV靶向大脑脉管系统可以作为中枢神经系统更好的生物工厂，用来表达治疗性蛋白，以治疗中枢神经系统疾病。在这项新研究中，研究团队通过定向进化和半理性工程设计，确定了一个基于AAV的家族，包括AAV-X1和AAV-X1.1，它们能够在小鼠体内特异性和有效地靶向大脑脉管系统内皮细胞。下面，让我们一起来简读一下Viviana Gradinaru团队的杰作：Functional gene delivery to and across brain vasculature of systemic AAVs with endothelial-specific tropism in rodents and broad tropism in primates.

AAV面临几大挑战：1.如何有效的穿过血脑屏障，AAV-PHP.eB已经解决^[1]；2.靶向的精准性？脑内皮细胞，可以选择AAV-BR1这个血清型，但是除了内皮细胞外，也会转染大量神经元和胶质细胞^[2]；3.AAV在不同物种间存在转染效率的差异，所以在临床转化的过程中，将AAV在非人灵长类动物(NHPs)中的在体实验纳入到整体实验进程中是必要的；4.AAV二次给药，会被抗体中和，而且单次、大剂量的AAV，毒副作用也相应增加。所以带着这些问题，我们一起来看一下Viviana Gradinaru团队的解决方案。

Result 1:新型AAV系统性注射后，特异性靶向小鼠脑内皮细胞

作者在AAV9的588-589碱基中插入小分子多肽（7个氨基酸），并将得到的病毒文库静脉注射到表达来自Tek(靶向内皮细胞)启动子的Cre转基因鼠中。经过两轮筛选，筛出了AAV-X1，为了比较新血清型间的差异，作者将单链AAV中，包装了广谱启动子CAG和EGFP，四种血清型分别为AAV-X1、AAV9、AAVPHP.V1、AAVBR1，尾静脉注射剂量为3E+11vg/只。标记效率比较结果显示：①AAV-X1在皮层、海马和丘脑中转导了约65-70%的GLUT1+(内皮标志物)细胞；②AAV-PHP.V1和AAV-BR1转导了约40%的GLUT1+细胞；③AAV9转导了约1%的内皮细胞。特异性结果显示：95%被AAV-X1转导的细胞为GLUT1+。相比之下，AAV-BR1和AAV-PHP.V1转导的GLUT1+细胞特异性要低得多，分别只有60%和40%的转导细胞是GLUT1+。AAV-BR1也靶向神经元，而AAV-PHP.V1也靶向神经元和星形胶质细胞。综上所述，与亲本载体AAV9相比，新载体AAV-X1不仅对中枢神经系统的靶向性有显著提高，而且对脑内皮细胞具有较高的特异性。

Result 2: 通过进一步的工程Cargo对X1的外周嗜性进行半理细化

AAV-X1展现脑内皮细胞极高的转导效率的同时，也保持了相似的肝脏转导水平（Figure 2A）。MicroRNA-122 (miR122)对肝脏具有高度特异性，其干扰靶点已被证明可降低肝脏中AAV的表达^[3]，于是作者将miR122的3个干扰靶点，串联（miR122TS）构建在AAV-X1-CAG-EGFP中，尾静脉注射后3周，观察结果显示：AAV-X1-CAG-miR122TS-EGFP，在肝脏中表达明显降低（Figure 2B）。进一步，作者将AAV-PHP.eB中，452-458的小分子多肽（7个氨基酸），插入到AAV-X1，构建了载体AAV-X1.1、AAV-X1.2、AAV-X1.3；此外，作者将AAV-X1中的N272或W503突变为丙氨酸，产生AAV-X1.4和AAV-X1.5，将AAV-X1中的S386突变为丙氨酸，产生AAV-X1.6。

Result 3: X1载体以不依赖ly6a的方式在不同小鼠品系和大鼠之间转导脑内皮细胞

作者前期的研究结果显示：AAV-PHP.eB与Ly6a结合，可以增加中枢神经系统的嗜性，并且Ly6a在小鼠品系之间的多态性有助于其品系特异性表型。为此，作者想探究AAV9-X1的CNS靶向性是否也依赖与Ly6a结合，测试结果显示：PHP.eB和PHP.V1表现出与Ly6a的强结合，解释了PHP的菌株特异性表型;而X1和X1.1均未结合Ly6a(Figure 3A)。这些结果表明X1及其衍生物利用了一种新的细胞靶向机制。

接下来，作者测试了AAV9-X1.1-CAG-tdTomato，在成年Listar大鼠中的递送效率，观察到载体在大鼠脑中强劲表达(Figure 3D)。复染Glut+后，证明AAV9-X1.1在不同物种间是保守的(Figure 3E)。

Result 4: 将X1的血清型从AAV9转换为AAV1，可以在小鼠中重复给药

某些应用需要重复递送AAV，首次给药产生的中和抗体，会影响二次给AAV的递送效率。为了解决这一问题，作者给出的策略是更换血清型，鉴于AAV-PHP.eB和AAV9-X1都是基于AAV9改造的，所以为了克服潜在的免疫障碍，作者将PHP.B血清型中的小分子多肽（7个氨基酸）构建到AAV1中：AAV1-PHP.B(Figure 4B),与AAV1相比，AAV1-PHP.B并没有明显的靶向性，然而相同的策略，作者将小分子多肽（7个氨基酸）肽插入到AAV1-X1中，AAV1-X1同样显示出强大的脑血管内皮靶向性（Figure 4C）。

为了测试AAV1-X1重复给药的潜力，且增加中枢靶向性，作者将AAV1-X1-Ly6a或AAV1.1-X1-Ly6a，注射到CBA/J小鼠中，表达3周后，再次将AAV-PHP.eB-CAG-EGFP注入相同小鼠。结果显示注射了AAV1-X1: CAG-Ly6a的CBA/J小鼠大脑中的EGFP表达增加，而注射了X1.1: CAG-Ly6a的小鼠则没有，说明AAV1-X1激活的血清型转换模式可能为小鼠的AAV再给药提供了潜在的解决方案。

Result 5: X1.1载体可以将脑内皮细胞转化为一个生物工厂，用于将分泌的蛋白质输送到大脑

血管在脑区各个角落的分布，使脑血管内皮细胞称为“生物工厂”成为可能。

SPARCL1/Hevin基因的下调或错义突变在许多神经系统疾病中都有报道，如自闭症、精神分裂症和抑郁症。在发育中的小鼠视觉皮层中，Hevin对于丘脑皮质连接的形成和可塑性是特别需要的。Hevin基因敲除小鼠(Hevin KO)在出生后的前三周和成年后都表现出明显的谷氨酸偶体转运蛋白2阳性(VGluT2+)丘脑皮质突触的缺失(Figure 4E)。为了确定脑内皮细胞异位表达Hevin是否可以挽救Hevin-KO小鼠的缺陷，作者使用AAV9-X1.1-CAG-Hevin-EGFP的载体，尾静脉注射Hevin-KO小鼠，3周后，结果显示：在脑内皮细胞中，Hevin蛋白稳健而特异性的表达(Figure 4F)。结果表明，由脑内皮细胞产生和分泌的Hevin能够模拟内源性Hevin功能，挽救Hevin-KO小鼠严重缺乏的丘脑皮质突触形成。因此，该系统说明了Hevin相关疾病的潜在治疗策略。

Result 6: X1载体家族在体外有效地转导人脑内皮细胞

AAV9-X1感染内皮细胞(HBMECs)在MOI为3*104时，X1转导了42%的HBMEC，比亲本AAV9高180倍。进一步设计的版本X1.1和X1.2分别转导了44%和53%的HBMEC。

Result 7: X1.1有效地转导体外培养的猕猴和人脑切片

AAV9-X1在HBMECs中的强大表现促使我们研究它们在系统中的功效，该系统可能更好地模拟非人灵长类动物体内条件。因此，作者转向体外脑切片培养系统（Figure 5B）。这些切片是从灵长类动物（长尾猕猴，Macaca Nemestrina）的大脑中新鲜提取的，并在体外培养。

7-10天后，我们从组织中提取DNA和RNA，并使用下一代测序(NGS)计算组织中AAV库中变体的富集程度。与AAV9相比，X1.1的DNA和RNA分别增加了4倍和25倍。值得注意的是，在离体脑切片中，X1.1诱导的蛋白表达主要见于神经元。结果说明：X1.1在猕猴和人类离体切片中的强劲表现(Figure 5F)表明，该衣壳在未来的转化中具有巨大的潜力。

完成了AAV9-X1.1在离体NHP和人脑模型中转导效率的验证后，作者进行了猴的体内实验。作者同时测试了AAV9-CAG-EGFP与AAV9-X1.1-CAG-EGFP，两种载体在新生恒河猴，每只猴5E+13vg/kg，表达4周后，作者观察到与AAV9相比，X1.1在包括皮层、舌回(LG)、海马和小脑在内的大脑区域有较强的表达(Figure 6B)，进一步的免疫组化染色显示，皮层中约98%的X1.1转导细胞是神经元，而一小部分靶向细胞是内皮细胞或胶质细胞(Figure 6D、E)。X1.1的神经元转导比AAV9高约45倍(Figure 6F)。

新生猕猴中X1.1的嗜神经谱与啮齿动物中X1.1的嗜内皮细胞谱之间的差异开辟了潜在的应用，并强调了跨物种分析AAV载体的必要性。这些实验表明，新的衣壳AAV-X1.1可以有效地转导旧大陆猴幼猴的中枢神经系统，使其成为研究神经系统疾病的潜在有用载体。

 小 结

本文讲解了一款新载体AAV-X1.1，尚未搭配内皮细胞的特异性启动子的时候，就已经展现出强劲的血管内皮细胞的精准靶向性。后续的吉凯内部测试中，如果新载体AAV-X1.1，搭配上特异性启动子（TIE或ICAM2），相信会有更好的效果。此外，作者还通过更换血清型，解决了中和抗体，影响AAV二次给药的难题。

目前吉凯基因正在生产AAV-X1.1的试用装，内部测试后，将会推广给老师们使用。

[参考文献]:

1. Chan, K. Y. et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat. Neu- rosci. 20, 1172–1179 (2017).

2.Ravindra Kumar, S. et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nat. Methods 17, 541–550 (2020).

3.sakova, A., Fehlmann, T., Keller, A. & Quake, S. R. A mouse tissue atlas of small noncoding RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 117, 25634–25645 (2020).