前言
长骨节段性缺损较难愈合一直是阻碍骨再生医学发展的重要问题。重组蛋白临床应用价格昂贵且用量多副作用大，已经不能满足日益提高的医疗需求。美国梅奥康复医学中心联合MERLN创新再生医学研究所的团队近日在Science Advances发表了题为‘Efficient healing of large osseous segmental defects using optimized chemically modified messenger RNA encoding BMP-2’的文章。文中应用通过化学修饰的mRNA替代重组蛋白递送到大鼠骨折部位促进骨重建再生，为骨愈合治疗提供了一种创新、安全、可转化的技术。
背景介绍
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，属于TGF-β家族。BMP能刺激DNA的合成和细胞的复制，促进MSCs定向分化为成骨细胞。它还是体内诱导骨和软骨形成的主要因子，并在肢体生长、骨折早期、软骨修复时表达，对骨骼的发育和再生修复起到重要作用。
再生医学为修复骨缺损和产生再生骨提供了新的解决方案。重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）等重组蛋白类新药已被批准在美国使用，但该类新药展现出的治疗效果却差强人意。寻找一种高效安全的局部基因递送方法成为更具有前景的研究思路。
mRNA是基因和其编码蛋白之间的媒介。与DNA疗法不同，不存在插入突变或其他遗传损伤的风险。编码特异性治疗蛋白的合成mRNA容易制备，并且可以通过廉价的非病毒载体递送到细胞内。但mRNA的不稳定性、细胞毒性和炎症特性阻碍了其在再生医学中的应用，对mRNA进行结构修饰和脂质载体递送同样也是目前研究重点。
文章中研究者评估了一种化学修饰的mRNA（cmRNA）编码的BMP-2修复大鼠股骨严重节段性缺损的能力。新生骨显示出与天然骨相当的力学性能，且没有重组蛋白使用后形成的大量骨痂。该研究提示了转录疗法在加速骨愈合方面的有效性和安全性。
研究内容
01
为了研究化学修饰的mRNA（cmRNA）的安全性和体内药物代谢，研究者对中段骨缺损的大鼠原位注射了携带萤火虫荧光素酶Fluc的cmRNA并进行活体成像，在除治疗部位外的其他身体部位未观察到荧光。给予cmRNA治疗后，体内产生大量的BMP-2蛋白，注射后第5天，蛋白质表达衰减至低水平。相比之下，应用重组人BMP-2蛋白在第1天达到高点后就开始逐渐减弱。该研究提示局部应用cmRNA的可行性及cmRNA药物代谢的优势。
Figure 1. Single application of FLuc cmRNA induces robust and localized luciferase activity in the bone but is absent from the circulation and essential organs.
02
研究者接下来对cmRNA应用的剂量依赖性进行了探究。当原位给予25ug及以上的cmRNA时产生的BMP-2蛋白能够愈合骨缺损。给药4周后，25ug的cmRNA剂量下骨愈合率为50%，50ug的剂量下动物骨缺损完全愈合。并且在使用cmRNA的愈合过程中，未观察到rhBMP-2引起的大量异位骨痂形成。μCT结果显示cmRNA组和rhBMP-2组新生骨小梁更薄，骨小梁厚度、数量和骨小梁分离度均相似。rhBMP-2组在治疗4-8周过程中存在骨丢失加速的现象，而cmRNA组则表现稳定。提示了应用cmRNA治疗的可取性。
在力学方面，愈合会恢复长骨的失效扭矩值。cmRNA组在治疗4周时恢复了天然骨的失效扭矩值，而此时rhBMP-2组的失效扭矩值仍然显著低于正常。8周时，仅cmRNA组的失效扭矩显著高于正常骨组。这表明cmRNA的作用可能使骨机械强度恢复更快。
Figure 2. Bone healing with BMP-2 cmRNA is dose-dependent; doses >25ug are necessary to heal critically sized bone defects reliably in rats.
03
研究者应用PCR芯片对cmRNA及rhBMP-2影响的成骨和基质形成相关基因进行了批量检测，结果显示二者均刺激了骨细胞外基质关键成分胶原、骨连接蛋白及转化生长因子等转录本上调。同时参与骨重塑的酶如基质金属蛋白酶和组织蛋白酶K也上调，提示骨缺陷修复过程中矿化组织环境的高度活跃。而只有cmRNA影响II型和X型胶原的转录本。II型胶原是软骨细胞的标志，X型胶原是软骨细胞肥大和软骨内骨化的标志。因此治疗方式的不同会导致骨愈合过程的差异，cmRNA引起软骨内骨化，rhBMP-2引起膜内骨化。
Figure 3. Expression of relevant osteogenic and extracellular matrix–related genes in newly formed tissue.
04
组织学检查证实cmRNA组和rhBMP-2组在4周和8周时骨缺损被桥接。Masson和HE染色均显示有皮质和骨髓重建的新骨生成。与cmRNA组相比，rhBMP-2组骨痂体积更大，皮质的修复却不明显，提示了cmRNA应用的安全性更好。cmRNA在较低浓度时能够增强X型胶原的表达，并刺激间充质前体的软骨形成，但无法进一步促进软骨内成骨。加大剂量到50ug后促进软骨内成骨继续到骨形成。cmRNA处理后TRAP阳性面积比显著增加，局部IL-17A和RANKL表达增加，表明与rhBMP-2相比，cmRNA治疗组织重塑效果更好。
Figure 4. BMP-2 cmRNA administration induces de novo bone deposition in the defect.
05
研究者又通过免疫组化发现经cmRNA治疗骨缺损中存在II型和X型胶原。这些胶原的表达在低剂量cmRNA治疗的骨缺损组别中最高。而II型胶原在50ug cmRNA治疗后期的缺损中已不可见，推测是因为足量cmRNA加快软骨内骨化修复。低剂量应用cmRNA治疗后X型胶原的表达弱于II型胶原，无法继续促进软骨内骨化。经50ug cmRNA处理的缺损在4周时X型胶原已不明显，证明足量的cmRNA治疗产生的II型和X型胶原能够加快修复进程。
Figure 5. Collagen type II deposition and chondrocytic cells are only visible within defects administered BMP-2 cmRNA,Collagen type X is clearly visible 4 weeks after BMP-2 cmRNA treatment but decreases at 8 weeks.
06
为了评估骨缺损治疗中局部炎症因子产生情况，研究者在手术和应用cmRNA或rhBMP-2后的不同时间，测定外周血中各种炎症因子、肿瘤坏死因子及抗炎因子的浓度。模型组和rhBMP-2治疗组没有发现细胞因子的增加。而在cmRNA治疗组中，细胞因子水平显著升高。单独使用非编码cmRNA会增加细胞因子的产生。当使用目的基因的cmRNA时，诱导炎症作用进一步增强。其中对促炎细胞因子IL-1a的诱导作用特别强。而对照cmRNA组诱导炎症的水平在第1天较低，所有组别细胞因子升高均在术后1天达到峰值，并持续至少10天。
Figure 6. Circulating cytokines elevated as a result of cmRNA application.
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