在Western Blot(WB)的实验过程中,总会遇到各种各样的问题:没有条带,杂带多,转膜不成功,曝光时间把握不好……不要着急,根据多年的WB经验,我们总结了以下WB实验过程中出现各种突发状况的分析和处理方法:
1. SDS-PAGE出现异常条带
1)微笑现象
处理方法:可能是由于凝胶的中间部分凝固不均导致,待其充分凝固后再做实验。
2)拖尾现象
处理方法:可能是由于样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起。建议:加样前离心;加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。
3)条带粗
处理方法:可能是由于浓缩胶未浓缩好。建议:增加浓缩胶长度;保证浓缩胶的pH正确(6.7);降低电压。
4)纹理现象
处理方法:可能是由于样本中不溶性颗粒引起的。建议:加样前离心;加适量样品促溶剂。
2. 转膜条件及膜的选择
下图为不同转膜方法的转膜效率:
可以观察到转膜效率:湿转过夜>湿转3小时>半干转1小时。
在转膜过程中,靶蛋白分子量小转印时间缩短,分子量大则适当延长转膜时间。并建议优先选择聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜,相对**纤维素(NC)膜机械强度高,和蛋白结合牢。
3. 条带出现降解或断裂带
lane 13:心脏组织震动溶解2h;lane 14:心脏组织短时超声;lane 15:心脏组织超声10min
处理方法:样本制备过程中尽量保持低温,避免蛋白变性、降解、断裂,对于胃肠胰等蛋白酶含量高的样本建议添加蛋白酶抑制剂,蛋白酶抑制剂建议新鲜配制。
4. 曝光时间过长或过短出现非特异性带或条带消失、
处理方法:建议选不同时间点多曝光几次。
5. 条带不整齐
处理方法:可能是由于胶凝固不均匀,建议待胶完全凝固后上样;可能是由于电泳的时候,有气泡在胶的下边缘,建议电泳前,检查并赶走胶底部的气泡;可能是由于上样buffer不是工作液浓度,建议重新配置上样buffer;可能是由于拔梳子导致样品孔不齐,建议水平缓慢的拔梳子。
6. 无条带
处理方法:可能是转膜失败,可以通过立春红染色检验;可能是一抗二抗用错或浓度不合适,可设置阳性对照或重新调整抗体浓度;ECL发光底物失效,可换用新的发光底物。
WB的实验流程相对较长,每个步骤都会对最后的实验结果造成影响。我们在实验过程中,应做好实验对照、实验记录,步步监测,方便查找原因。
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