用兔抗LF的多克隆抗体包被成固相酶标板，以识别并结合待测标本中的LF,用抗原标记生物素（Bio-Ag），用亲和素标记辣根酶(HRP-A)，向固相酶标板中同时加入标准品（或待测品）和Bio-Ag，两者竞争性的结合到固相抗体上，反应、洗涤后，加入HRP-A，反应、洗涤后，酶标板上形成Ab-Ag-Bio-A-HRP和Ab-Ag复合物，加酶底物显色，用酶标仪在相应波长下测定光密度（OD值），根据标准曲线，计算出待测标本中的LF含量。

试剂盒组成

1.  真空包装96孔固相酶标板一块。

2.        冻干的标准品7瓶：分别用标准稀释液1.0mL溶解，浓度为0、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、5.0µg/mL 。

3.  生物素化抗原（Bio-Ag）1瓶：5mL。

4.  酶结合物1管：20µl，用前每µl加缓冲液1mL稀释。

5.  HRP-A 稀释液 1 瓶：10mL。

6.  显色剂：A为冻干品：2瓶，B为液体：2瓶。 临用前1瓶A加1瓶B溶解。

7.  终止液1瓶：5mL。

8.  洗涤液1瓶：用前用蒸馏水20倍稀释。

9.  实验缓冲液 1 瓶：10 mL

注意事项

1 操作    ⑴为保证实验结果的准确性，标准品必须做双孔；条件允许的情况下标准、质控、样品均应做双孔。 ⑵为防止样品蒸发，试验时应将反应板铺于有湿布的密闭盒内。⑶血清、枸橼酸盐或EDTA抗凝血浆均可检测，但血清或血浆中残存凝块或红细胞须经离心去除。⑷标本在2-8℃可贮存3天，超过3天应放入-20℃，避免反复冻融。 ⑸分别用加样器头吸取每份标本，避免相互交叉。⑹底物易于氧化且对光敏感，一定要用前配置，用后的底物液必须弃去，不可再用。⑺显色时室温应在20-25℃。

2 试剂盒储存条件    ⑴试剂盒所有试剂均储存于4℃。⑵酶标板在真空条件下可存放6个月，打开后若不能一次用完，请装于密封性好的袋子内，于4℃干燥处保存，并在一个星期内使用。⑶标准品溶解后于4℃保存可使用一个月。⑷Bio-Ag、HRP-A每次吸取时应尽量避免污染，4℃保存可使用6个月。若液体出现浑浊则活性不可再用。

样品准备

取静脉血分离血清，待测；如不立即测量，可将样本密封后，置于2~8℃或-20℃储存备测，2~8℃保存不应超过48小时，-20℃保存不超过2个月。

操作步骤

1. ELISA测定LF操作步骤见下表：  加样量（µl）

操作完后用酶联仪在490nm波长测量各孔OD值。

2 计算 ⑴用酶标仪上的ELISA自动分析软件对所测OD值进行处理，选双对数法绘制曲线，直接得出样品浓度。⑵以标准物浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（对数坐标），在对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应浓度。

本试剂盒的技术参数

1 灵敏度：本测定法灵敏度为0.1µg/mL。

2 精密度：用本法同时及不同时间检测8份样品，批内变异系数7.4，批间变异系数为6.3。

3 准确度：⑴该抗血清与CRP（10µg/mL）、 巨球蛋白(270mg/mL)、 a 1-AT（81 μg /mL）均无交叉反应。⑵向已知浓度血清中加入定量的LF抗原测定回收率，其低浓度回收率为93.8 , 高浓度回收率为103.3 。

正常参考值

正常献血员血清样品80份测得正常参考值： 0.255-0.621µg/mL。

建议各实验室应根据条件建立自己的正常对照组。