1  人外周血单个核细胞分离

1.1  转移血液样品

人工采集外周血50-100ml，用酒精棉球擦拭血袋外表面后放入生物安全柜。预先打开2个50ml离心管，用止血钳夹住血袋引流管的中部，剪刀在引流管中部靠外剪断引流管，将血液平均转入两个50ml离心管中，旋紧盖子。

1.2  血细胞富集

将上述装好转移到50ml离心管中的血液离心。条件为2000rpm×，8min，20℃。离心后将上层血浆转移到一新的离心管中，留下沉淀细胞。

1.3  用人淋巴细胞分离液分离单个核细胞

估计血细胞体积，按体积比1：1用生理盐水悬浮血细胞。新打开2个50ml离心管，每管加入适量的人淋巴细胞分离液（总体积约为细胞悬液体积的1/2，每管15ml左右）。用25ml的移液管把血细胞悬液缓缓加入到有人淋巴分离液的离心管中。注意血液要加到淋巴分离液的上层，勿打破人淋巴分离液的界面。将加好的血细胞液放入离心机离心。条件为2000rpm×20min，20℃，降速设置为零。

1.4  收集单个核细胞

将上述离心好的样品缓缓放入生物安全柜，对光照可以看到样品在离心管里分成四层，从上到下依次为生理盐水和少量血浆层、单个核细胞层、淋巴分离液层、粒细胞红细胞层。用10ml移液管小心吸弃生理盐水和少量血浆层，然后小心将单个核细胞层吸出转移到1个50ml离心管中。

1.5  单个核细胞洗涤

向收集单个核细胞的离心管中添加生理盐水到45ml，旋紧盖子颠倒混匀，20℃，进行3次梯度离心洗涤，收集细胞沉淀。条件依次为1800rpm×8min； 1500rpm×8min； 1200rpm×8min。

2  单核细胞贴壁分离

2.1  将上述离心后的细胞沉淀用2ml无血清培养基悬浮混匀，吸取20ul细胞悬液计数。

2.2  根据细胞数量，添加无血清培养基稀释细胞悬液，使细胞终浓度为 3×106个/ml。

2.3  将细胞悬液分加到6孔板中，每孔3ml。将6孔板送入CO2培养箱中培养。培养条件为5%CO2，60min。

2.4  取出六孔板，在生物安全柜中用10ml移液管小心吹打六孔板中液体，吸出未贴壁细胞置 50ml离心管中。向六孔板每孔缓缓加入2ml生理盐水， 再将生理盐水小心吸出，收集合并到上述50ml离心管中， 离心（1200rpm×min，8min，20℃）后可作为DC细胞培养。

3  自体血浆灭活

将装有自体血浆的离心管放在56℃水浴锅中孵育30min，每10min振荡摇匀一次。灭活后的血浆离心，条件为2500rpm×10min，20℃。弃掉沉淀，将上层血浆转移到一个新的离心管中。

4  单个核细胞诱导成树突状细胞（DC）

4.1  按需要配制诱导培养基，培养基ml数=六孔板孔数×4ml,在培养基里面添加GM-CSF，终浓度100ng/ml，IL-4终浓度100ng/ml，添加1%的自体血浆。

4.2  

d0  每孔添加2ml的诱导培养基，放入培养箱培养。

d2  每孔添加1ml的诱导培养基，放入培养箱培养。

d4  每孔添加1ml的诱导培养基，放入培养箱培养。

d5  添加TNF-α，终浓度25ng/ml。放入培养箱培养. 观察细胞形态并记录。

d7  收集细胞计数并留样做流式检测。用5ml移液管吹打六孔板，收集细胞培养液到50ml离心管中，离心，1500rpm×8min，20℃。

备注：每天观察培养基的颜色变化、细胞形态并作相应记录。

产品官网链接：https://www.bioind.com/worldwide/biotarget-1-sfm/

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