还原型谷胱甘肽测定试剂盒 微量法
产品名称: 还原型谷胱甘肽测定试剂盒 微量法
英文名称: Micro Reduced Glutathione (GSH) Assay Kit
产品编号: BC1175
产品价格: 0
产品产地: 北京市通州区马驹桥联东U谷85A三
品牌商标: Solarbio
更新时间: 2024-11-26T09:29:08
使用范围: null
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产品内容:
试剂一:液体 1 瓶,100mL,4℃保存。
试剂二:液体 1 瓶,20 mL,4℃保存。
试剂三:液体 1 瓶,8 mL,4℃避光保存。
标准品:粉剂 1 支,10mg,4℃避光保存。
产品说明:
谷胱甘肽是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)组成的天然三肽,是一种含巯基(—SH)的化合物,广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-(2-**苯甲酸)(5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid,DTNB)反应产生2-**-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。2-**-5-巯基苯甲酸为黄色产物,在波长412nm处具有最大光吸收。
自备仪器和用品:
分析天平、微量匀浆器(规格 2mL)、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计或酶标 仪、超微量比色皿或 96 孔板。
样品的处理
1、组织处理:
新鲜组织首先用PBS冲洗2次,然后称取动物组织或者植物组织0.1g。加入用试剂一润洗过的匀浆器中(匀浆器提前放冰上预冷);然后加入1ml试剂一(组织/试剂一比例保持不变即可),迅速冰上充分研磨(使用液氮研磨效果更好);8000g 4℃离心10min;取上清液放置于4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存10天)。
2、血液处理
血浆:将收集的抗凝血于4℃,600g离心10分钟,吸取上层血浆到另一支试管中,加入等体积的试剂一, 4℃,8000g离心10分钟,将上清移入新的试管中放置于4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存10天)。
血细胞:将收集的抗凝血于4℃,600g离心10分钟,弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗3次(用PBS重悬血细胞,600g离心10分钟),加入等体积试剂一,混匀后4℃放置10分钟,8000g离心10分钟,吸取上清放于4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存10天)。
3、细胞处理
收集不少于106个细胞,首先用PBS清洗细胞2次(PBS重悬细胞,600g离心10分钟),加入3倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞,反复冻融2-3次(可在液氮中冻结,37℃水浴中溶解),8000g离心10分钟,收集上清于4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存10天)。
操作步骤
1、分光光度计预热30min以上,分光光度计调节波长至412nm,蒸馏水调零。
2、试剂二放置37℃(哺乳动物)或25℃(一般物种)水浴中保温30min。
3、空白管检测:取1ml比色皿,依次加入100μL蒸馏水,700μL试剂二,200μL试剂三,混匀,放置2min后测定412nm吸光度A1。
4、制作标准曲线
称1mg标准品用1ml蒸馏水溶解,浓度为1mg/ml。取适当溶液配制浓度为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml的标准品(试剂一十倍稀释后进行稀释)。
取1.5mlEP管依次加入100μL标准品,700μL试剂二,200μL试剂三,每管混匀后静置2min,检测412nm处吸光度,吸光度减去空白孔(A1)为横坐标,根据吸光度(x)和浓度(y,μg/ml)做出标准曲线。
5、样品管测定:取1ml比色皿,依次加入100μL样品,700μL试剂二,200μL试剂三,混匀后静置2min检测412nm处吸光度A2,△A= A2- A1。
GSH含量计算
根据标准曲线,将样品△A带入公式中(x),计算出样品浓度y(μg/ml)。
(1)按蛋白浓度计算
GSH(μg / mg prot)=y×V 反总÷V 样÷Cpr =y×10÷Cpr
(2)按样本质量计算
GSH(μg /g)= y×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)= y×10 ÷W
(3)按细胞数量计算
GSH(μg /104 cell)= y×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)= y×10 ÷细胞数量
(4)按液体体积计算
GSH(μg / mL)= y×V 反总÷V 样= y×10
V 反总:反应总体积,1mL;V 样总:上清液总体积,1 mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1 mL;W:样品质量,g ;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL。